ZEISS Lightsheet 7

Ihr Lichtblattmikroskop für das Multiview-Imaging lebender und gekl?rter Proben

 

Die biowissenschaftliche Forschung stellt hohe Anforderungen an Ihre Bildgebungskapazit?ten: Nicht selten müssen lebende Modellorganismen als Ganzes abgebildet sowie Gewebe und Zellen w?hrend ihrer Entwicklung dargestellt werden. Mit ihrem einzigartigen Beleuchtungsprinzip erm?glicht die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM, Light Sheet Fluorescence Microscopy) das schnelle und schonende Abbilden dieser Proben. Die besonders hohe Stabilit?t von Lightsheet 7 sorgt dafür, dass lebende Proben über l?ngere Zeitr?ume – sogar über Tage – mit weniger Phototoxizit?t als je zuvor beobachtet werden k?nnen. Darüber hinaus lassen sich mit diesem Lichtblattmikroskop sehr gro?e optisch gekl?rte Proben sowohl als Ganzes als auch in subzellul?rer Aufl?sung abbilden. Die speziellen Optiken, Probenkammern und Probenhalter von Lightsheet 7 k?nnen auf den Brechungsindex der gew?hlten Clearing-Methode eingestellt werden, um gro?e Proben, beispielsweise ganze Mausgehirne, zu betrachten. Mehr Flexibilit?t, als mit dem stabilen geschlossenen Lichtblattmikroskop von ZEISS, werden Sie kaum woanders finden.

Highlights

  • Abbildung optisch gekl?rter Proben

Die Auswahl einer geeigneten Clearing-Methode h?ngt von verschiedenen Faktoren ab: von der Art des Gewebes, der verwendeten Fluoreszenzmarker und der Gr??e der Probe. Lightsheet 7 passt sich an alle Bedingungen an. Sie k?nnen jetzt Proben von bis zu zwei Zentimetern in nahezu allen Clearing-L?sungen mit einem Brechungsindex von 1,33 bis 1,58 abbilden. Das stabile Lichtblattmikroskop erstellt direkt übersichtsbilder und Daten in subzellul?rer Aufl?sung. Für optisch gekl?rte Organoide, Sph?roide, Organe, Gehirne oder andere Proben gilt: Lightsheet 7 ist das Mikroskop der Wahl für die schnelle und schonende LSFM-Bildgebung.

 

C57/BL6J-Maus, perfundiert mit PBS, CellTracker? CM-DiI-Farbstoff und 4 % PFA. Nach dem iDISCO+-Protokoll gekl?rt, Zimts?ureethylester als letzte RIMS.

Probe mit freundlicher Genehmigung von Erin Diel – Harvard University; Harvard Center for Biological Imaging Room 2052, 16 Divinity Ave, Cambridge, MA 02138, USA


  • Beste Bildqualit?t und Stabilit?t

Das einfach zu bedienende Lightsheet 7 hebt Ihre LSFM-Bildgebung auf ein neues Niveau. So erzielen Sie die bestm?gliche Bildqualit?t in einem breiten Anwendungsspektrum.
Neu entwickelte Optiken und Probenkammern sorgen für die optimale Anpassung an den Brechungsindex. Der neue Probenhalter vereinfacht das Befestigen gr??erer Proben. Intelligente Softwaretools helfen die Abbildungsparameter zu definieren, u. a. Lichtblatt- und Probenpositionen, korrekte Zoomeinstellungen, Tiles & Positions sowie Datenverarbeitungsparameter. Alle neuen Funktionen gehen Hand in Hand mit der zuverl?ssigen Kombination von Laserscanning und Zylinderlinsen von ZEISS, um die Lichtblattbeleuchtung zu erzeugen. Die patentierte Pivot-Scan-Technologie liefert artefaktfreie optische Schnitte in bester Bildqualit?t.

Spezielle Optiken für Ihr ZEISS Lightsheet 7
  • Schnell und schonend echtes Leben betrachten

Lightsheet 7 bietet mit den hocheffizienten sCMOS-Detektoren (pco.edge) die M?glichkeit, schnellste Prozesse bei geringer Beleuchtungsintensit?t zu erfassen. So k?nnen Sie Vorg?nge in Ihren lebenden Proben direkt beobachten, ohne dass Anregungslicht negative Auswirkungen auf die Ergebnisse hat. Für vertikal ausgerichtete Proben und h?chste Bildraten kann der CMOS-Detektor ZEISS Axiocam 702 verwendet werden. Die spezielle Probenkammer kann gew?rmt, gekühlt oder mit CO2 angereichert werden und bietet so die optimale Umgebung für Experimente mit lebenden Zellen. Hinzu kommen Multiview- und Triggeroptionen, um externe Ger?te zu steuern. Damit ist Lightsheet 7 das ideale Lichtblattmikroskop zur Beobachtung von laufenden Prozessen in einer nahezu unbegrenzten Bandbreite von Organismen.

Entwicklung einer Arabidopsis
Entwicklung einer Arabidopis-Blüte – Probe mit freundlicher Genehmigung von S. Valuchova, P. Mikulkova und K. Riha, Central European Institute of Technology (CEITEC), Masaryk-Universit?t, Brno, Tschechische Republik.

Das Prinzip der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) teilt die Fluoreszenzanregung und -detektion in zwei separate Lichtwege, wobei die Beleuchtungsachse senkrecht auf der Detektionsachse steht. Das bedeutet, dass jeweils nur ein einzelner, dünner Bereich der Probe beleuchtet wird. Dabei entsteht ein inh?renter optischer Schnitt, weil nur die Fluoreszenz der Fokusebene angeregt wird. Lochblenden und Bildbearbeitung sind nicht erforderlich. Das Licht aus der Fokusebene wird auf den Pixeln einer Kamera gesammelt und nicht Pixel für Pixel ausgelesen wie mit Konfokal- oder anderen Laser-Scanning-Mikroskopen. Die Parallelisierung der Bilderfassung auf einem kamerabasierten Detektor erm?glicht schnellere Bildraten mit weniger Anregungslicht als bei vielen anderen Mikroskopietechniken. Zusammenfassend verbindet LSFM das optische Schnittverfahren mit paralleler Bilderfassung der gesamten Brennebene. Das macht 3-D-Imaging extrem schnell und überaus lichteffizient.

Die Entkopplung der Detektionsoptiken von den Beleuchtungsoptiken erm?glicht die Fluoreszenzanregung mithilfe spezieller Linsen mit niedriger numerischer Apertur, und das ohne Einbu?en bei der Detektionsaufl?sung und -empfindlichkeit. Damit ist die LSFM ideal für die Abbildung von Proben im Millimeterbereich, beispielsweise sich fortlaufend entwickelnder Organismen oder gro?en gekl?rten Gewebeproben.

LSFM-Beleuchtungsprinzip Lightsheet 7

Funktionsweise des Lightsheet 7

 

Sehen Sie in der Animation, wie einfach Ihre Proben mit ZEISS Lightsheet?7 positioniert und abgebildet werden k?nnen.

Der patentierte Pivot-Scanner

für homogene Ausleuchtung

Wenn das Lichtblatt die Probe durchdringt, absorbieren oder streuen einige Strukturen der Probe, z. B. Zellkerne, das Anregungslicht. Dabei werden entlang der Beleuchtungsachse Schatten geworfen (Abbildung links). Dieser Effekt tritt bei allen Fluoreszenzmikroskopen auf, doch bei der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie steht die Beleuchtungsachse senkrecht auf der Detektionsachse, sodass dieser Effekt deutlicher wird. Beim Lightsheet 7 ver?ndert ein patentierter Pivot-Scanner den Winkel des Lichtblatts w?hrend der Bildaufnahme nach oben und unten. Dadurch fallen die Schatten in unterschiedliche Richtungen und das Anregungslicht erreicht auch Bereiche hinter opaken Strukturen (Abbildung rechts). Dieser patentierte Pivot-Scanner tr?gt auf ideale Weise dazu bei, artefaktfreie Bilder aufzunehmen und die sp?teren Verarbeitungs- und Analyseschritte zu optimieren. Es ist immer besser, potentielle Artefakte direkt an ihrem Ursprung zu beseitigen.

ZEISS Lightsheet 7 im Einsatz

Nephrologie

Mausniere, nach dem iDISCO-Protokoll gekl?rt und in Zimts?ureethylester mit der ZEISS Lightsheet 7-Detektionsoptik 5×/0,16 foc. und Clr 20×/1,0 nd. = 1,53 abgebildet (Ausschnitt). Zur Darstellung der Vaskulatur und der Glomeruli (rot) wurde die Maus mit DyLight-594-konjugiertem Tomato Lektin eingef?rbt. Grün: Autofluoreszenz zur Abbildung der Gewebeanatomie. Die 3D-Abbildung ganzer Organe und die rechnergestützte Bildanalyse der Gr??e und Anzahl der Glomeruli tr?gt dazu bei, das Wissen über die Mechanismen verschiedener Nierenerkrankungen wie der diabetischen Nephropathie zu erweitern. Mit arivis Vision4D? auf ACQUIFER HIVE verarbeitet.

 

Probe mit freundlicher Genehmigung von U. Roostalu, Gubra, D?nemark.

 

Probe mit freundlicher Genehmigung von U. Roostalu, Gubra, D?nemark.

Entwicklungsbiologie

3D-Datensatz einer P10-Maustrachea mit anatomischer Anordnung der mechanosensorischen Nervenfasern. F?rbung: DAPI, Collagen IV (Alexa-488-Antik?rper), sensorische Fasern (Reporterstamm mit tdTomato-Expression, Alexa-555-Antik?rper), Neurofilamentprotein NF200 (myelinierte Nervenfasern, Alexa-647-Antik?rper).
Die Probe wurde in PEGASOS gekl?rt (Jing et al, 2018, Cell Research) und in BB-PEG mit einem RI von 1,54 mit der Detektionsoptik 5×/0,16 foc. bzw. Clr 20×/1,0 nd = 1,53 abgebildet. Datensatz mit 5× Vergr??erung: Pixelskalierung 0,61 × 0,61×1,63 Mikron, 3 × 3 Kacheln, Zoom 1,5×, 1.230 z-Schnitte, Volumen 2,57 × 2,58 × 2 mm; Datensatz mit 20× Vergr??erung: Pixelskalierung 0,23 × 0,23 × 0,58 Mikron, 1 × 5 Kacheln, Zoom 1,0×, 4.206 z-Schnitte, Volumen 2,0 × 0,45 × 1,82 mm.

 
 

Probe mit freundlicher Genehmigung von P.-L. Ruffault, C. Birchmeier, Laboratory of Developmental Biology/Signal Transduction; A. Sporbert, M. Richter, Advanced Light Microscopy; M.-Delbrück-Zentrum für Molekulare Medizin, Berlin.

Extremit?ten- und Rückenmarksregeneration bei Wirbeltieren

Salamander haben die bemerkenswerte F?higkeit, ihre Extremit?ten und das Rückenmark zu regenerieren. Mit molekulargenetischen Hilfsmitteln k?nnen nicht nur die Stammzellen identifiziert werden, die für diese komplexe Regeneration zust?ndig sind, sondern auch die als Verletzungsreaktion entstehenden Signale, die ihre Proliferation ausl?sen. Dieses Axolotl-Vorderbein wurde in Zimts?ureethylester gekl?rt (Masselink W. et al, Development 146, 2019) und mit der Detektionsoptik 5×/0,16 foc. und einem Brechungsindex von 1,57 abgebildet.
Der Multikachel-Datensatz wurde mit der ZEN-Bildgebungssoftware und der arivis Vision4D?-Software auf einer ACQUIFER HIVE-Datenplattform ausgerichtet, fusioniert und gerendert.

 

Probe mit freundlicher Genehmigung von W. Masselink, Tanaka Lab, Research Institute of Molecular Pathology, IMP.
Bild mit freundlicher Genehmigung von P. Pasierbek, K. Aumayr, IMP BioOptics, Wien, ?sterreich.

Neuromorphologie

Die Abbildung ganzer Zellen im menschlichen Gehirn ist angesichts der au?erordentlich hochentwickelten Morphologie der Neuronen und ihrer Verteilung im gesamten Organ nahezu unm?glich. Organoiden erm?glichen in gewissem Ma?e ein besseres Verst?ndnis des Gehirns, u. a. wie Neuronen in neuronalen Stammzellenkulturen entstehen. Mithilfe des ECi-Clearing l?sst sich die Neuromorphologie von der lokalen bis zur globalen Ebene untersuchen, was faszinierende M?glichkeiten für die Untersuchung der Neuronmorphologie in 3D er?ffnet.
35 Tage alte neuronale Organoide, mit GFP/tdTomato markiert (3 % GFP und 3 % tdTomato) und mit Objektiv Clr 20×/1,0 nd = 1,53 abgebildet.
Pixelskalierung: 222 × 222 × 567 nm.
Bildvolumen: 1,66 × 0,66 × 1,6 mm.

 

Probe mit freundlicher Genehmigung von D. Reumann und J. Knoblich, IMBA, Wien, ?sterreich.

Immunologie

Die Abbildung intakter Lymphorgane in 3D erm?glicht die Analyse und Quantifizierung der Immunantwort auf Virusinfektionen. T-Zellen wurden in Wildtyp-Wirtsm?use transferiert. Der Lymphknoten wurde mit Ce3D (Li et al, PNAS 163, 2017) gereinigt, fixiert und gekl?rt und dann mit RI = 1,49 (ph 7) mit der Detektionsoptik 5×/0,16 abgebildet (Volumen 2,5 × 2,5 × 1,6 mm). Das Bild zeigt GFP-markierte native CD8+-T-Zellen (gelb), mit B220 (cyan) eingef?rbte B-Zellfollikel sowie die CD31-Vaskulatur (magenta).

Maus-Leistenlymphknoten

Probe mit freundlicher Genehmigung von Joanna Groom, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australien.

Abbildung der Vaskulatur eines ganzen Mausgehirns

Eine C57/BL6J-Maus wurde mit PBS und 4 % PFA perfundiert. Das Gehirn wurde mit Cell-Tracker? CM-DiI-Farbstoff perfundiert und eingef?rbt; dieser flüssige Farbstoff markiert die Vaskulaturmembranen. Die Probe wurde nach dem iDISCO+-Protokoll gekl?rt und in Zimts?ureethylester als letzter RIMS ?quilibriert. Anschlie?end wurde die Probe in Zimts?ureethylester mit RI = 1,565 mit der Detektionsoptik Fluar 2,5×/0,12 in einer Transluzenz-Mesoskala-Bildgebungskammer abgebildet.

Das hochaufl?sende Einsatzbild rechts wurde mit Clr Plan-Neofluar 20×/1,0 Korr. nd = 1,53 erfasst.
Das Bildvolumen betr?gt 13,1 × 13,1 × 6 mm bei einer Pixelaufl?sung von 1,83 × 1,83 × 6,77 μm. Die Erfassung erfolgte in etwa 40 Minuten in 4 × 4 Kacheln mit 866 z-Schnitten.
Das Datenvolumen liegt bei 93 GB. Die Daten wurden mit der ZEN-Bildgebungssoftware und mit arivis Vision4D? auf einer ACQUIFER HIVE-Datenplattform verarbeitet.

 
 

Probe mit freundlicher Genehmigung von E. Diel, D. Richardson, Harvard University, Cambridge, USA.

Abbildung der Interneuronen und Purkinje-Zellen eines ganzen Mausgehirns

Ein PV-tdTomato-Mausgehirn wurde nach dem CLARITY-Protokoll gekl?rt, die endgültige Bildgebung erfolgte in EasyIndex mit einem Brechungsindex von RI = 1,46.
Parvalbumin-Cre-erzeugende Expression von tdTomato – Parvalbumin wird in einer Population von Interneuronen im gesamten Gehirn sowie in Purkinje-Zellen im Kleinhirn exprimiert. Der Datensatz für das gesamte Gehirn wurde mit einem ZEISS Lightsheet 7 mit der Detektionsoptik 5×/0,16 foc. erfasst. Das Bildvolumen betr?gt 11 × 20 × 8,8 mm bei einer Pixelaufl?sung von 0,91 × 0,91 × 5,35 μm (12.028 × 22.149 × 1.621 Voxel). Die Erfassung erfolgte in 6 × 10-Kacheln mit 1.621 z-Schnitten. Das Datenvolumen liegt bei 1,2 TB (805 GB nach Stitching). Die Daten wurden mit der ZEN-Bildgebungssoftware und mit arivis Vision4D? auf einer ACQUIFER HIVE-Datenplattform verarbeitet.

 

Probe mit freundlicher Genehmigung von E. Diel, D. Richardson, Harvard University, Cambridge, USA.

Downloads

ZEISS Lightsheet 7

Light sheet fluorescence microscopy for Multiview imaging of living and cleared specimens.

Seiten: 26
Dateigr??e: 8850 kB

ZEISS Lightsheet 7

Light sheet fluorescence microscopy for Multiviewimaging of living and cleared specimens.

Seiten: 4
Dateigr??e: 1871 kB

Technology Note: A Methodology Review

How to Get Better Fluorescence Images with Your Widefield Microscope.

Seiten: 11
Dateigr??e: 1885 kB

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How to Get Best Images with Various Types of Immersion Media and Clearing Agents

Seiten: 10
Dateigr??e: 2077 kB

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